מלחמות הקריספר

לפני כחודשיים דחה בית המשפט לערעורים בארצות הברית את ערעורן של חוקרות מאוניברסיטת ברקלי, והעניק את הפטנט על טכנולוגיית CRISPR-Cas9, שמאפשרת עריכת גֵנים בתאים בעלי גרעין (אאוקריוטיים), למכון ברוד (Broad) השייך לאוניברסיטת הרווארד ולמכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס (MIT). אף שמדובר רק בפטנט ראשון מני רבים, ההחלטה תשפיע על היחס לשלל פטנטים אחרים בתחום פורץ הדרך הזה. לכן יש לה משמעות עמוקה בכל מה שנוגע להשקעה של חברות ביוטכנולוגיה וחברות תרופות בטכנולוגיית קריספר, ולכן על הפוטנציאל שלה לקדם את איכות חיינו בתחומי הבריאות, החקלאות ועוד. זהו שלב חשוב בפיתוח טכנולוגיית קריספר, אך עדיין לא סוף הסיפור.

מהנדסה גנטית לעריכה

בשנות ה-70 התגלו בחיידקים חלבונים בשם "אנזימי הגבלה" (Restriction enzymes), שיכולים לחתוך DNA. הקוד הגנטי של כל היצורים החיים מורכב משרשרת של מולקולות שנקראות בסיסים ומתחלקות לארבעה סוגים: ציטוזין (C), אדנין (A), גואנין (G) ותימין (T). האנזימים הללו מסוגלים לחתוך את ה-DNA בדיוק במקום שבו מופיע רצף מסוים – למשל AATT או CATATG. אנזימי ההגבלה, שבינתיים זוהו כמה מאות מהם, משמשים את החיידקים להגנה מפני נגיפים שתוקפים אותם: הם חותכים את ה-DNA של הנגיפים וכך משמידים אותם.

בנוסף, ישנו אנזים שיודע לחבר קצוות של DNA. כשחותכים DNA בעזרת אנזימי הגבלה ומדביקים אותו מחדש בשילובים שונים, אפשר להעביר גֵנים בין יצורים, ליצור מוטציות ולחקור את פעילותם של הגֵנים. ברוב המקרים הגֵן הנחקר משולב לתוך פלסמיד – מעין מקטע DNA עצמאי שאפשר להחדיר לאורגניזם הנחקר.

עם זאת, גם כיום עדיין מסובך מאוד לעשות מניפולציה על גֵנים. ראשית, אפשר לחתוך ולהדביק רק במקומות מאוד מסוימים שאנזימי ההגבלה מכירים, ולא בכל מקום שרוצים. המצב מסתבך אפילו יותר במקרים שבהם גֵן מכיל כמה אתרי חיתוך של אותו אנזים הגבלה. שנית, גֵן שנמצא על פלסמיד אינו מתנהג כמו גֵן שנמצא במקומו הטבעי בגנום, שכן לפלסמיד חסרים גורמי בקרה רבים שקיימים בגֵנים רגילים. פעמים רבות הפלסמידים גם נמצאים בתא בעותקים רבים, בניגוד לשני עותקים בלבד של הגֵן.

בנוסף, אצל חיידקים ויצורים חד-תאיים פשוטים אחרים כמו שמר האפייה, אפשר לעשות מניפולציות יעילות על גֵנים באמצעות תהליך שנקרא "רקומבינציה הומולוגית", כלומר הכנסת מקטע DNA מלאכותי בעל קצוות קצרים (כחמישים בסיסים בדרך כלל) במקום מקטע קיים שבקצותיו יש רצף זהה של בסיסים. לעומת זאת, אצל יצורים מורכבים יותר כמו זבובים ויונקים, ובייחוד בתאים שקשה לגדל בתרבית, כמו תאי גזע עובריים, זהו תהליך מורכב מאוד, יקר ולא יעיל.

תקוות גדולות

התקווה הגדולה של ההנדסה הגנטית עוד מתחילתה הייתה לפתוח פתח לריפוי גֵני – תיקון מוטציות שגורמות למחלות, וכך לרפא לחלוטין מני סרטן ומחלות גנטיות. הניסיון הראשון בריפוי כזה נעשה כבר ב-1990 עם ילדה בת ארבע שלקתה במחלת כשל חיסוני נדירה בשל חסר של אנזים מסוים בתאי מערכת החיסון. החדרת האנזים באמצעות נגיף לתאי מערכת החיסון שלה הביאה להחלמתה.

למרות ההצלחה, הטכנולוגיה לא התפתחה כמצופה. מותו של מטופל שעבר ריפוי גני בשנת 1999, והופעת סרטן דם אצל ילדים שעברו טיפולים דומים בצרפת בלמו את המשך הפיתוח של הטכנולוגיות הללו.

ואז הגיע קריספר. בשנות ה-80 וה-90 התגלו במינים רבים של חיידקים רצפים חוזרניים קצרים שתפקידם לא היה ברור. הרצפים הללו כונו קריספר (ראשי תיבות של Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). בהמשך התברר שהם מכילים גם קטעי DNA של בקטריופאג'ים, נגיפים שתוקפים חיידקים.

חוקרים מסוימים, בהם פיליפ הורבאת' (Horvath) מחברת המזון דאניסקו, ראו בזה רמז עבה לכך שהמנגנון עשוי להיות מערכת חיסון נגד בקטריופאג'ים. מכיוון שמינים רבים של חיידקים רבים נמצאים בשימוש בתעשיית המזון, למשל בייצור גבינות ויוגורט, לגילוי מערכת חיסון חיידקית חדשה היה פוטנציאל כלכלי רב.

הורבאת' הראה שקריספר היא אכן מערכת חיסון נרכשת, כלומר, לומדת עם הזמן לזהות את המטרה שלה ותקוף אותה באופן ספציפי. מחקרים נוספים פענחו בהמשך את מנגנון הפעולה של קריספר. בקצרה, מקטעי ה-DNA של קריספר מתועתקים למולקולות RNA קצרות שעוברות חיתוך והתאמה ואז חוברות יחד לחלבון חותך DNA בשם Cas9. כשנגיף חודר לתא החיידק, רצפי ה-RNA נקשרים ל-DNA הנגיפי המתאים להם, ו-Cas9 חותך את הDNA הנגיפי וכך משמיד את הנגיף.

הטכנולוגיה של ריפוי גני לא התקדמה כמצופה, אולי השימוש בקריספר יביא לפריצת דרך. טיפול גני בילד | צילום: Shutterstock

מהפכת עריכת הגנום

מהפכת הקריספר נולדה בתחילת העשור הנוכחי. בשנת 2011 הראה הורבאת' עם וירג'יניוס סיקסניס (Siksnys) מאוניברסיטת וילנה בליטא, שקריספר פועלת כמערכת עצמאית, כיוון שאפשר להעביר מערכות קריספר ממין אחד של חיידק למין חיידק אחר. כעבור שנה פיענחו השניים את מנגנון הפעולה של Cas9, ואף הראו שאפשר לתכנת אותו לחתוך רצף DNA מסוים על-ידי הכנסת רצף RNA תואם לנגיף.

באותו חודש בדיוק פורסם מאמרן של עמנואל שרפנטיה (Charpentier) וג'ניפר דואודנה (Doudna) מאוניברסיטת ברקלי, שהתקדמו צעד אחד הלאה. הן חיברו את שתי מולקולות ה-RNA למולקולה יחידה (שנקראת sgRNA) וכך הפכו מערכת מסורבלת ומרובת מרכיבים למערכת נוחה לשימוש בת שני חלקים בלבד. במאי 2012 הגישו השתיים בקשה לפטנט על מערכת קריספר/Cas9, אך לא ציינו בבקשה לפטנט, וגם לא במחקרן, שהיא יכולה לשמש גם בתאים בעלי גרעין.

בשנת 2013 הראו שתי קבוצות מחקר שונות, האחת של פנג ז'אנג (Zhang) ממכון ברוד והשנייה של ג'ורג' צ'רץ' (Church) מאוניברסיטת הרווארד שאפשר להשתמש בקריספר לעריכת גֵנים בתאי אדם. הם הראו שבהפעלת החלבון Cas9 עם sgRNA שמכוון לרצף מסוים בגנום האדם, Cas9 אכן גורמת לו לחתוך את ה-DNA באותו מקום. ה-DNA החתוך מתוקן על ידי מנגנוני התיקון של התא, אך מכיוון שהם אינם מושלמים, בחלק מהתאים תיווצר מוטציה באזור החיתוך. כך אפשר להכניס מוטציות לגֵנים במקומם הטבעי ועל ידי זה לחקור את תפקידם.

בנוסף קיים בתאים מנגנון תיקון שמשתמש ברקומבינציה הומולוגית, שהיא כאמור החלפה של מקטעי DNA שלמים. אם מספקים לתאים מקטע DNA שחלקו זהה לאזור החתוך וחלקו שונה, התא יכניס את המקטע החדש לאזור החיתוך. כך אפשר לחבר חלקי גֵנים שונים, להחליף גֵנים ועוד, והכול במקומם הטבעי ב-DNA.

המערכת שפיתח ז'אנג זכתה לפופולריות רבה כמעט בין לילה. תרם לכך גם Addgene, ארגון ללא מטרות רווח שמקבל ממדענים פלסמידים עם גֵנים שונים ומפיץ אותם למדענים בכל העולם במחיר העלות. זאנג הפקיד ב-Addgene את מערכת קריספר/Cas9 שלו, שהופצה לכל דורש, ובתוך שנתיים פלסמידים של קריספר כבר הופצו לכ-15 אלף מעבדות.

אבות רבים לפטנט (וגם אמהות רבות): למעלה מימין: דואודנה ושרפנטייה, למטה מימין: צ'רץ' וז'אנג | צילומים: ויקיפדיה

מלחמת פטנטים

עד מהרה הגיש גם ז'אנג בקשה לרשום פטנט על המערכת, וציין בה במפורש שהשימוש אינו מוגבל רק לחיידקים אלא גם לתאים בעלי גרעין. בקשתו הוגשה בדצמבר 2012 וכעבור פחות משנתיים העניק לו משרד הפטנטים בארצות הברית את הזכויות על הפטנט.

אולם הפונטציאל המסחרי של השיטה שווה הרבה כסף, ובאוניברסיטת ברקלי לא ראו בעין יפה את המהלך של מתחריהם, שכן שרפנטיה ודואודנה הקדימו את ז'אנג בהגשת הבקשה לפטנט. כך גם טענו בערעור שהגישו. אולם המצב המשפטי היה מורכב, מפני שהפטנט הראשון עסק בעריכה גנטית בחיידקים בלבד והיה פחות מקיף מזה של ז'אנג.

סלע המחלוקת המשפטית נעוץ במושג יחיד בחוק הפטנטים. לפי החוק, כדי שפטנט יתקבל עליו להיות חדש, שימושי ולא מובן מאליו. כמו כן, פסיקה של בית המשפט העליון של ארצות הברית משנת 2013 אסרה לרשום פטנט על DNA טבעי, כגון גֵנים של אדם או מוטציות בגֵנים שגורמות למחלות, שכן מדובר בתופעת טבע, ולא בטכנולוגיה חדשה.

אין כמובן ספק שקריספר היא מערכת חדשה ושימושית. כמו כן המערכות שונו מאלו שקיימות בטבע, כדי שנוכל להשתמש בהן לעריכת גֵנים ולכן אין איסור על רישום הפטנטים עליהן. אבל האם מובן מאליו שאפשר להשתמש במערכת שמקורה בחיידקים גם בתאים בעלי גרעין?

במהלך הדיון בבית המשפט בדצמבר 2016 טענו נציגי ברקלי שדואודנה "רצתה להוכיח לפני הכול שהמערכת עובדת בחיידקים, אבל ידעה שהיא תפעל גם בתאי יונקים". בנוסף הביאו ביוכימאי מומחה שטען כי חוקרים לא משקיעים זמן, מאמץ וכסף במחקר שהם לא מאמינים שיצליח, ואכן חוקרים נוספים עבדו באותו זמן על התאמת המערכת לתאים בעלי גרעין, לא רק מעבדתו של ז'אנג.

השופטים לא קיבלו את הטענות הללו. בנוסף, נציגו של מכון ברוד ציטט ראיונות של דואודנה בתקשורת שבהם דיברה על הקשיים שלה בהתאמת המערכת לתאים בעלי גרעין. "זה בדיוק הפוך מלהיות מובן מאליו", טען. בתחילת 2017 פסק משרד הפטנטים לטובת מכון ברוד, ובתחילת ספטמבר השנה נדחה גם הערעור שהגישה אוניברסיטת ברקלי. עדיין לא ברור אם ברקלי תנסה לערער גם לבית המשפט העליון.

אולם הסיפור לא מסתיים כאן, שכן באירופה מצב הפטנטים שונה. אוניברסיטת ברקלי זכתה בחודש מרץ בשני פטנטים על קריספר באירופה, ואילו הפטנט העיקרי של מכון ברוד נשלל בגלל מחלוקות על שמות החוקרים הרשומים על הפטנטים.

המקור: מערכת חיסון של חיידקים למאבק בנגיפים שתוקפים אותם. בקטריופאג' תוקף חיידק | איור: Science Photo Library

מערכת גמישה

קריספר/Cas9 היא המערכת הפופולרית ביותר לעריכת גֵנים ולכן המאבק על הפטנט הזה נמצא בקדמת הבמה. אולם ככל שהתרחבה התפוצה של המערכת במעבדות בעולם, כך גדלו גם השימושים בה.

מערכות קריספר התגלו כאמור בחיידקים רבים ולכל מערכת יש תכונות שונות מעט. ז'אנג, למשל, הוציא פטנטים על Cpf1 – חלבון קטן יותר מ-Cas9, ועל Cas13a – מערכת קריספר שחותכת RNA ולא DNA. גם דואודנה רשמה פטנטים על מערכות אחרות, כגון CasX ו-CasY.

גם למערכת קריספר/Cas9 עצמה יש עשרות וריאציות שונות, אם לא למעלה מכך. חלקן הן התאמות שנעשו עבור אורגניזמים שונים (אין דין שמרים כדין זבובים, צמחים או עכברים). באחרות נעשו שינויים שאיפשרו למערכת לבצע דברים שונים לגמרי. למשל, אם משתמשים ב-Cas9 שעבר מוטציה שמונעת ממנו לחתוך DNA, אפשר להביא חלבונים אל המקום הרצוי ב-DNA.

חלק מהשימושים האלה מכוסים על ידי הפטנט שרשמה אוניברסיטת ברקלי באירופה. בשיטת CRISPRi, למשל, מאחים לתוך Cas9 חלבון שפוגע בשעתוק של גֵן מסוים, ואילו ב-CRISPRa מאחים אותו עם חלבון שדווקא גורם להפעלה תמידית של הגֵן. אפשר להביא ל-DNA חלבונים שיסמנו אותו בצבע פלואורסצנטי וכך לראות במיקרוסקופ היכן נמצא גֵן מסוים בגרעין יחסית לגֵנים אחרים. יש כיום שיטות שמאפשרות עריכה של בסיס יחיד, ולא רק של מקטעי DNA ארוכים יחסית. והשימושים מתרבים והולכים.

הנדסה גנטית של חיידקים שונה לגמרי מהנדסת תאים בעלי גרעין. פלסמיד של DNA בתוך חיידק | איור: Science Photo Library

העתיד של עריכת הגֵנים

למרות המאבק על הפטנטים, שוררת בתחום עריכת הגֵנים רוח של שיתוף פעולה. שיתוף מערכות הקריספר השונות דרך Addgene קידם את המחקר הקשור לקריספר בתוך שנים ספורות. נכון להיום יש ב-Addgene למעלה מ-6,400 פלסמידים שקשורים לקריספר. לפי גוגל, המילה קריספר מופיעה ביותר מ-50 אלף מאמרים שפורסמו מאז 2012. והאתר Free Patents Online מזהה למעלה מ-880 פטנטים שהמילה CRISPR מופיעה בתקציר שלהם. יותר מ-450 מהם כבר אושרו בארצות הברית.

במישור העסקי, קבוצה של חברות מסחריות ואוניברסיטאיות, ובהן CRISPR genomics, Intellia therapeutics, Caribou Bioscience ו- ERS genomics הכריזו בסוף שנת 2016, יחד עם אוניברסיטת ברקלי, דואודנה, שרפנטיה ואוניברסיטת וינה, על הסכם שיתוף זכויות קניין על קריספר. הסכם נוסף בין מכון ברוד, אוניברסיטת וילנה, חברת פיוניר, וכן קריבו ו-ERS שכבר הזכרנו, נועד לשתף זכויות קניין על קריספר לשימושים חקלאיים.

פיוניר כבר בישרה על שימוש בקריספר ליצירת זני תירס עשירים בעמילן. לשימושים החקלאיים בקריספר יש יתרון גדול על פני השיטות הישנות, שכן הם אינו דורשים להשתמש בחיידקים או מחוללי מחלות אחרים ובגֵנים שלהם לצורך הנדסה גנטית של צמחים. לכן השימוש בקריספר עוקף את הרגולציה המגבילה של משרד החקלאות האמריקאי. השימוש בעריכה גנומית ממוקדת באמצעות קריספר מאפשר למשל לתרבת צמחי בר לצמחים מניבי פירות בתוך דור יחיד.

רישיונות למחקר קליני ניתנים כרגע בעיקר דרך החברות השייכות לאוניברסיטאות – קריבו של ברקלי ו-Editas של מכון ברוד, דבר שעלול ליצור צוואר בקבוק בתחום. אולם בינתיים נראה שכבר נעשים ניסויים קליניים עם מערכות קריספר.

הפטנטים של מכון ברוד ושל ברקלי הם כלליים למדי, אולם פיתוחים רפואיים חדשים עשויים להתקבל משילוב של כמה גורמים ייחודיים לטיפול ספציפי. למשל עשויים להוציא פטנט על טיפול שכולל את רצף ה-sgRNA, חלבון Cas מסוים ודרך מסוימת להכניס אותם לתאים או להפעיל אותם בתוך התא, כמו גם על תהליך ייצורם לשימוש קליני, אופן החדרתם לחולים והליך המעקב אחרי המטופלים. כמו כן ייתכן שחברות ירצו לפצל את הפטנטים כך שעל כל חלק בתהליך יהיה פטנט נפרד.

ההחלטות בנושא הפטנט של קריספר/Cas9 ישפיעו בהכרח על כל פטנט עתידי שקשור לקריספר. למשל, האם השימושים החדשים "מובנים מאליהם" כהמשך הפיתוח של מערכת קריספר/Cas9? יש שיגידו שכן, אך מכיוון שכל פיתוח נוסף של מערכת קריספר כרוך בהמצאה של שיטה חדשה ומצריך מחקר משמעותי, ייתכן שהרשויות יסתפקו בזה. בנוסף, השקעה בטכנולוגיית קריספר למחקרים רפואיים תעלה בהכרח הון רב, ויש חשש שחברות ביוטכנולגיה לא ירצו להשקיע בתחום אם לא יוכלו ליהנות מהגנה של פטנטים.

אף על פי שמערכת הקריספר התגלתה לפני יותר מעשרים שנה, השימוש בה לעריכת גֵנים קיים בקושי שש שנים. בתוך תקופה קצרה להדהים היא הגיעה כמעט לכל מעבדת מחקר בעולם וכבר משמשת לייצור חקלאי ולניסויים רפואיים. מלחמת הפטנטים על קריספר נמצאת עדיין בעיצומה, אך ייתכן מאוד שעם מערכות קריספר חדשות שמפותחות כל הזמן הפטנטים הישנים יהיו פחות רלוונטיים. סבך הפטנטים הגדל ידרוש מהרשויות פתרונות יצירתיים כדי לא לפגוע במחקר ובפיתוח וכדי לשמור את זכויות הקניין של הממציאים.

צפו בסרטון של Nature על מערכת CRISPR/Cas9 (כתוביות בעברית): 

קישורים לקריאה נוספת:

The Heroes of CRISPR: מאמר מאת אריק לאנדר על גילוי מערכת קריספר ותפקידה.

The CRISPR Patent Landscape: Past, Present, and Future: מאמר מאת ג'ייקוב שרקוב על מצב הפטנטים של קריספר (נכון לפברואר 2018).

Disruption and development: the evolving CRISPR patent and technology landscape: מאמר מאת דייוויד לים על מצב הפטנטים של קריספר (נכון ליוני 2018).