ה-PCR, או בשמה המלא Polymerase Chain Reaction, היא שיטה שחוללה מהפיכה בביולוגיה המולקולרית ובמחקר הגנטי, וזיכתה את ממציאה בפרס נובל. הגאונות של השיטה, היא הקלות בה היא מאפשרת יצירת כמות אדירה של DNA מכמות זעומה על ידי שימוש באמצעים פשוטים יחסית. ב-PCR נעשה שימוש לא רק במחקר ביולוגי, אלא גם בבדיקות גנטיות, בדיקות זיהוי פלילי, מחקר רפואי ולמעשה כל יישום המערב שימוש ב-DNA. הסרטונים שלפנינו מתארים את שיטת ה-PCR על שלביה השונים. הסרטון השני מכיל הסברים באנגלית, על כן הוספנו תרגום והסברים בהמשך העמוד.

סרטון זה הופק בידי PHG foundation ותורגם על-ידי צוות אתר דוידסון אונליין.

הכפלת DNA מתבצעת על ידי הפרדת הגדילים, התחברות אנזים ה- DNA polymearase לאחד הגדילים על באזור ההפרדה אל על גבי פריימר (תחל) וסנתיזה של ה-DNA ל פי תבנית הגדיל. ה-PCR עושה שימוש בעקרון זה, רק שהוא חוזר על השלבים עשרות פעמים ובכך מכפיל את כמות ה-DNA פי שתיים בכל שלב, כלומר 30 שלבים יצרו מעל מליארד עותקים מ-2 עותקים. היופי שבשיטה הוא שהיא לא מגבירה את כל ה-DNA, אלא רק מקטע ספציפי אותו קובעים מראש. לשם כך בוחרים זוג פריימרים (תחלים) - קטעי DNA התוחמים את האזור אותו רוצים להגביר. כל פריימר מתאחה עם גדיל אחר ובכך מגדיר את מקטע ההגברה.

ל-PCR שלושה שלבים מחזוריים, המתאפיינים בטמפרטורת עבודה שונה. מרכיבי התגובה הם: תבנית DNA דו גדילי, זוג פריימרים, נוקלאוטידים (אבני הבניין של ה-DNA), האנזים DNA polymerase ותמיסת מלחים המאפשרת את קיום התגובה.

שלבי התגובה הם: דנטורציה (פרימה), אנילינג (איחוי) אלונגציה (התארכות). שלב הדנטרציה מתבצע ב-95 מעלות, ובמהלכו שני גדילי ה-DNA נפרדים. שלב זה אורך כחצי דקה. בשלב האנילינג, מתאחים שני הפריימרים על הגדילים המנוגדים. שלב זה מתבצע בטמרטורה של בין 45-70 מעלות וזה תלוי באורך והרכב הפריימרים. בשלב האלונגציה, נקשר ה-DNA polymerase אל הפריימרים ומתחיל לסנתז DNA במורד הגדיל.

בתום המחזור הראשון, אם יצאנו ממולקולת DNA יחידה קיבלנו שתי מולוקולות DNA לא שלמות כלומר מסונתזות החל מהפריימר שנקשר אליהן. בתום המחזור השני נקבל כבר ארבע מולקולות מתוכן אחת מכילה רק את המקטע הרצוי. בתום השלב השלישי, כבר יהיהו לנו שמונה מולקולות DNA מתוכן ארבע מכילות רק את המקטע הרצוי. בתום השלב הרביעי יהיו לנו 16 מולקולות DNA מתוכן 8 מכילות את המקטע הרצוי וכך כמות ה-DNA רק עם המקטע הרצוי יגדל באופן לוגריטמי (מעריכי).בתום התגובה, מספר מולוקולות המכילות שאריות מה-DNA המקורי שאינו במקטע הנבחר יהיה כל כך נמוך ביחס לשאר, שזה יהיה זניח, וזאת משום שקצב הריבוי שלהם הינו קצב ישר (לינארי) אם יש 30 שלבים, יהיו 60 מולקולות ביחס ליותר ממליארד המולוקולת של המקטע.

שיטת ה-PCR הולידה שיטות רבות כמו ה-realtime PCR המאפשרת מעקב בזמן אמת אחר קצב התרבות ה-DNA, מכאן ללמוד על קצב ביטוי הגן אותו הוא מקודד. שיטה נוספת היא ה- RT-PCR. שיטה זו מאפשרת הפיכת RNA ל-DNA על ידי הוספת האנזים reverse transcriptase שמקורו בוירוס ה-HIV והופך RNA ל-DNA ואז הגברתו. שיטה זו מאפשרת חקר ביטוי גנים ברקמות או תאים שונים. PCR משמש גם להוספת אתרי חיתוך אנזימטיים או מוטציות בקטעי DNA ולעוד יישומים רבים ומגוונים.

 

מאת: ארז גרטי
המחלקה לכימיה ביולוגית
מכון ויצמן למדע

הערה לגולשים
אם אתם חושבים שההסברים אינם ברורים מספיק או אם יש לכם שאלות הקשורות לנושא, אתם מוזמנים לכתוב על כך בפורום. אנו נתייחס להערותיכם. הצעות לשיפור וביקורת בונה תמיד מתקבלות בברכה.

14 תגובות

  • אלעד

    qRT-PCR

    מה ההבדל בין qRT-PCR לבין RT-PCR? איזה מידע ניתן לקבל מהראשון שלא ניתן לקבל מהשני?

  • יוסי ב

    חישוב מספר השרשראות המבוקשות המתקבלות

    שלום רב, תודה על ההסבר,
    כיצד ניתן לחשב את מספר השרשראות המבוקשות המתקבלות. למשל אחרי המחזור הראשון לא מתקבלות שרשראות מבוקשות כלל (כלומר לא שרשראות נוקלאוטידים הגובלות בתחלים.
    האם יש נוסחה?
    תודה

  • מירא

    CDNA

    שלום מה ההבדל בין dna לבין cdna ומה זה משנה באיזה אחת להשתמש בתהליך של ה PCR? ,USV

  • טל

    שאלה!! דחוף

    א.תאר שני מאפיינים דומים בשני התהלכים PCR , ושכפול DNA.
    ב.ציין והסבר שני שימושים שתהליך ה-PCR מנוצל בהם לתועלת האדם.

  • לימור ברזילי

    תשובה ב

    א.שימוש בתחלים לצורך הגברה..שימוש באנזים דנא פולימראז על מנת להמשיך את השכפול מאיזור התחלים והלאה
    ב.זיהוי פלילי ובדיקת אבהות

  • מומחה מצוות מכון דוידסוןארז גרטי

    תשובה

    צר לי אבל אנחנו לא עונים על שעורי בית

  • אביטל

    תוצרי ה-PCR

    1. מדוע חשוב לנקות את תוצר ה–PCR?
    2. ישנה שיטה נוספת לקבלת גן רצוי, מלבד ריאקציית PCR, ניתן לחתוך את הגן הרצוי ישירות מפלסמיד. מהם היתרונות ווהחסרונות לכל שיטה (חיתוך מפלסמיד לעומת PCR).

  • מומחה מצוות מכון דוידסוןארז גרטי

    תשובה

    שלום אביטל
    אנחנו לא נוהגים לענות על שעורי בית באתר, אך אתן לך רמז לשתי השאלות:

    1. מה נמצא בראקצית הPCR, חוץ מהDNA המוגבר ואיך זה יכול להפריע לך בהמשך?

    2. גם כאן, מה ה"יבול של התוצר" בכל אחת מהשיטות, מה החומרים שצריך להפטר מהם ובמקרה של תוצרי PCR, וחסרון נוסף של הPCR קשור ליעילות הDNA פולימראז.

    בהצלחה
    ארז

  • אוה

    אל תפרסמו את זה אבל תתקנו את המילה מעקב. לא מעכב, אלא מעקב...

    פסקה אחרונה

  • מומחה מצוות מכון דוידסוןארז גרטי

  • רותי

    שאלה על RT

    האם האנזים RT צריך פריימר על-מנת לבנות גדיל DNA על-גבי גדיל של RNA?

  • מומחה מצוות מכון דוידסוןארז גרטי

    תשובה

    שלום רותי

    כל ראקציית PCR זקוקה לפריימרים, גם RT-PCR וזאת משום שהפולימראז זקוק לאתר על מנת "להתיישב" עליו ולהתחיל בשכפול. היות וראקצית RT-PCR על פי רוב משמשת לבניית ספריית cDNA משתמשים בפריימר כללי כמו poly A או בפריימרים אקראיים אשר נותנים מספר רב של תוצרים ולמעשה את רוב המקטעים הקיימים בספרייה. עם זאת ניתן גם לעשות ראקציית RT-PCR גם כלפי מקטע ספציפי עם פריימר ספציפי.

    מקווה שעזרתי

    ארז

  • אילן

    PCR

    מספר שאלות הקשורות לריאקציית ה-PCR:
    1. במידה ומופיע התוצר הרצוי ויחד עמו גם מעט תוצרים לא ספציפיים, אילו פרמטרים רצוי לשנות כדי לשפר את התוצאות?

    2. האם יש חשיבות למשך זמן הדנטורציה וזמן האיחוי? מדוע נעדיף זמן קצר יותר של השניים?

  • עידו קמינסקי

    תשובה

    שלום אילן
    משאלתך אני מבין שאתה סטודנט לביולוגיה כמוני. אינני מומחה גדול לביולוגיה מולקולרית, אך אשתדל לתרום לך מנסיוני הדל:

    1. הופעת תוצאים נוספים לא ספציפים, מקורה באיחוי הפריימרים לאזורים בDNA אשר דומים אך לא זהים למקטע הרצוי. על מנת להוריד את ההסתברות לכך עליך לשחק עם הפרמטרים הבאים:
    טמפרטורה - העלאת טמפרטורת הanealing מקשה על הפריימרים להקשר לDNA ועל כן הספציפיות הקישור עולה. הייתי ממליץ לך לקחת את אותה הדוגמא בדיוק, לחלק אותה לכמה מבחנות ולהריץ אותן באותה התוכנית באותוה מכשיר (gradient PCR) עם טמפרטורת anealing משתנה.
    כמות המחזורים - הפריימר לרוב "יעדיף" להקשר לאזור אשר הכי דומה לו (או יותר נכון לומר להופכי שלו). אם תפחית את כמות המחזורים תוריד את ההסתברות של תוצרים לא ספציפים לעבור הגברה (אך גם תחליש את התוצר הנכון)
    ריכוז מגנזיום - לעיתים משחק עם ריכוזי מגנזיום (הורדה שלו במקרה שלך) מסייע לפתור את הבעיה,
    אנזים - לעיתים שימוש באנזים אחר פותר את הבעיה
    פריימרים - אולי כדאי לך לתכנן פריימרים חדשים (אם הניסוי שלך מאפשר זאת).

    2. לזמן הדנטורציה והאיחוי אין חשיבות משמעותית (עד כמה שידוע לי) בד"כ הם פרק זמן קבוע של כחצי דקה, ההתארכות לעומת זאת, מושפעת מאורך מקטע הDNA אותו אתה רוצה להגביר. במקרה שלך אם תקצר מעט את זמן הanealing זה עשוי לסייע, משום שלפריימרים יהיה פחות זמן להקשר, דבר שעשוי להעלות את הספציפיות.

    אם דבר מהתנאים שהצעתי לא מצליח, תשקול אולי חיתוך של הband הרלוונטי מהג'ל, ושימוש בו, אם הוא חלש מדי אז להגביר אותו שוב בPCR עם אנזים בעל פעולת תיקון טובה.

    ואם כלו כל הקיצין תנסה את שיטת nested PCR, כלומר הגברה של מקטע גדול יותר של DNA עם פריימרים מחוץ למקטע הסופי שאתה רוצה, ואז PCR נוסף עם הפריימרים המקוריים על התוצר שקיבלת - במצב כזה הייתי מייעץ לך להשתמש באנזים בעל פעולת תיקון טובה (כמו PFU או vent) בשביל להנמיך את הסיכון למוטציות לא רצויות.

    מקווה שעזרתי

    ארז