לפני כ-50 בודד פרופ' אוסמו שימאמורה את חלבון ה-GFP (חלבון פלורסנטי ירוק) ממדוזת הAequore .victoria כשלושים שנה לאחר מכן, עם התפתחות ההנדסה הגנטית, שובט הגן לחלבון הזה ובוטא בהצלחה בחיידקי E. coli, דבר שפרץ למעשה את הדרך לתחום מדעי חדש המשלב בין ביולוגיה מולקולרית למיקרוסקופיה.
כיום קיימות כבר אינספור שיטות שבהן משתמשים בהצמדת חלבונים פלורסנטים לגנים שונים בתא וכך מאפשרים מעקב אחר תהליכים ביולוגים שונים. בסרטון שלפנינו נראה כמה תהליכים שעושים שימוש בחלבונים ובסמנים פלורסנטיים.
סרטון זה הופק בידי חברת Molecular Probes ומציג חלק ממוצריה.
על מנת להבין את חשיבות ה-GFP ואת אופן השימוש בו אנו ממליצים לצפות גם בסרטונים: GFP – החלבון הפלורסנטי הירוק; הבסיס המולקולרי להנדסה גנטית; FRET – מעבר אנרגיה ליצירת פלורסנציה; ומהי פלורסנציה?
בסרטון ראינו כמה שיטות למעקב אחר תהליכים ביולוגים. התהליכים המתוארים שונים זה מזה, אך השיטות שבהן משתמשים זהות – שיבוט חלבון גן שמכיל בתוכו את רצף הגן המדווח המצומד לגן החלבון הפלורסנטי, ביטויו בתאים וצפייה בהם במיקרוסקופ. הסרטון אינו כולל הסברים או סימוכין לשיטות המוצגות, על כן נציג כאן כמה הסברים אפשריים. יתכן שההסברים אינן מדויקים תמיד ברמת החלבון המסומן בסרטון, אולם כולם אפשריים מבחינה מדעית.
פעילות תרופות אנטי סרטניות: במקרה זה אנו רואים את שלד התא צבוע בירוק, את גרעין התא בכחול ואת המיטוכונדריה (כנראה) באדום. ככל הנראה מדובר בתאים סרטניים וניתן לראות כיצד הם גוססים לאטם אחרי הטיפול בתרופה. שימו לב לשינויים בשלד התא (ירוק) ולתנועת המיטוכונדריה (אדום).
סימון תאים ע"י Qdot: לחלבונים פלורסנטיים יש כמה מגרעות, אחת מהן היא הצורך להמתין בין יום ליומיים עד שהם מתבטאים ברמה שניתן לראותם. לא תמיד יש לנו זמן לכך, במיוחד בתהליכים מהירים או רגישים. לשם כך קיימים צבעים שחודרים את הממברנה.
אחד מאלה הוא צבע בשם Qdot המבוסס על חלקיקים גבישיים. לגבישים הללו מצמדים סמן פלורסנטי ונוגדן המוביל את הסמן לחלבון הרצוי. אפשר להשתמש בכמה סוגים של נוגדנים כאלה במקביל ולסמן כמה חלבונים בצבעים שונים. בסרטון רואים חדירה של Qdot לתא.
חלוקת התא: כשתא מתחלק הוא עובר כמה שלבים המאופיינים בפעילות מסוימת ומביאים לידי ביטוי חלבונים שונים שממלאים תפקיד בשלב הרלוונטי (למידע נוסף אתם מוזמנים לצפות בסרטון כאשר תאים מתחלקים [מיטוזה]). בסרטון, בכל שלב בחלוקה סימנו חלבון אחר בצבע אחר, וכך ניתן לזהות את המעבר בין שלבי החלוקה השונים על ידי השינוי בצבע התא.
שינויים בשלד התא: כדי לצפות בתהליכים תוך-תאיים שמערבים שינויים בשלד התא, כגון תנועת תאים, שינוי מבנה מורפולוגי וחלוקה, נהוג לצבוע את רכיבי שלד התא, אקטין וטובולין, בצבעים שונים המבוסס על חלקיקים גבישיים – אדום וירוק בהתאמה. בסרטון אנו רואים חלוקת תאים.
צביעה נפוצה נוספת היא של היסטונים – חלבונים שקושרים דנ"א. בעת החלוקה, הדנ"א מתלפף סביב ההיסטונים ובכך נארז באופן קומפקטי (למידע נוסף אתם מוזמנים לצפות בסרטון כיצד הדנ"א ארוז בתוך הגרעין?). אריזת הדנ"א מעידה על הכנה לחלוקה. כשהחלוקה אינה מתרחשת כשורה, ניתן לראות זאת היטב על פי מיקום המיקרוטובולים וההיסטונים בתא.
שימוש בסמני חומציות בתגובה החיסונית: כשתאים בולעניים בולעים חיידק או נגיף, הם משנעים אותו לאנדוזום – אברון שהחומציות בו מתגברת בהדרגה עד שהחיידק או הנגיף מפסיקים להיות פעילים (ובמקביל מפורקים על ידי אנזימים מתאימים. ראו סרטון הפעלת התגובה החיסונית ע"י חלבוני TLR). סמנים של חומציות מאפשרים לראות את התהליך זה מתרחש (שימו לב לנקודות האדומות בתא).
תנועת אברונים בתא: על ידי סימון של חלבון שנמצא באופן מובהק באברון מסוים ניתן לזהות את מיקומו של האברון, ואם מדובר במיטוכונדריה ניתן גם לעקוב אחר תנועתה בתא. פעמים רבות צובעים אברונים שונים בתא במקביל לצביעת החלבון הנבדק כדי לראות היכן הוא ממוקם, כלומר לבדוק אם רואים את הפלורסנציה שלו באותו מקום שבו רואים את הפלורסנציה של האברון הנבדק. הצביעה צריכה כמובן להיעשות בצבע אחר.
מבנה הממברנה: אפשר לסמן חלבונים ממברנליים נפוצים וכך לעקוב אחר שינויים במבנה הממברנה.
שינויים בריכוזי הסידן בתא: הסידן הוא מתווך חשוב מאוד בתהליכים ביולוגים רבים. שינויים בריכוז הסידן מעידים על פעילויות של תהליכים שונים בתא. קיימים צבעים שקושרים סידן חופשי ויוצרים פלורסנציה. הצבעים האלה אינם מבוססים בהכרח על חלבון, אלא לעתים משתמשים בכימיקלים שנותנים פלורסנציה או משנים את צבעם כשהם קושרים סידן.
בסרטון ניתן לראות אינדיקטור שמאפשר לנו להעריך את ריכוז הסידן התוך-תאי באמצעות הצבע שהוא מקבל. לעתים משתמשים בכמה אינדיקטורים שהיעילות שלהם משתנה בריכוזים שונים של סידן, וכמובן בצבע שונה. ייתכן שזה המצב בסרטון.
בסרטון ראינו כמה שיטות צביעה נפוצות בביולוגיה של התא. קיימים עוד צבעים רבים ושימושים רבים שלא צוינו כאן. מה שראיתם אינו אלא קצה הקרחון. בזכות אותם סמנים פלורסנטים, ביחד עם מיקרוסקופיה מתקדמת, אפשר כיום לחקור תהליכים בתא, ואפלו ביצור החי, בלי לפגוע בהם.
ארז גרטי
דוקטורנט, המחלקה לכימיה ביולוגית
מכון ויצמן למדע
הערה לגולשים
אם אתם חושבים שההסברים אינם ברורים מספיק או אם יש לכם שאלות הקשורות לנושא, אתם מוזמנים לכתוב על כך בפורום. אנו נתייחס להערותיכם. הצעות לשיפור וביקורת בונה תמיד מתקבלות בברכה.