PCR (ראשי תיבות של polymerase chain reaction) היא שיטה שבאמצעותה מגבירים מקטעי DNA על ידי רצף של מחזורי חימום, המדמים את תהליך שכפול ה-DNA. אחת מהשיטות הנגזרות שלו, ה-Realtime PCR מאפשרת לקבל  תוצאות כמותיות יותר המעידות על קצב הגברת ה-DNA בעזרת חומרים פלורסנטיים. לשתי השיטות מאפיינים דומים, אך שימושים שונים. הסרטון שלפנינו מראה את השלבים השונים של שתי השיטות ועומד על היתרונות הבולטים של ה-Real-time PCR .
 

סרטון זה תורגם בידי צוות דוידסון אונליין
הסרטון הופק בידי חברת scanelis

 

ה-PCR ראשי תיבות של polymerase chain reaction (תגובת שרשרת של DNA פולימראז), הינה שיטה בביולוגיה מולקולרית, שנועדה להגביר מקטעי DNA. עקרון השיטה, שזיכתה את ממציאה בפרס נובל, הוא מאוד פשוט. חימום של DNA דו גדיל לחום גבוה (95 מעלות) הגורם להפרדות הגדילים (שלב הדנטורציה או פרימה), קירור לטמפרטורה של 45-70 מעלות גורם להצמדות קטעי DNA קצרים (פריימרים או תחלים) אל אתרי ההתאמה שלהם (אנילינג או איחוי), וחימום ל-72 מעלות המאפשר סינתיזה של גדיל DNA משלים החל מהפריימר ואילך (אלונגציה או התארכות). חזרה על מחזור כזה מספר רב של פעמים (עשרות) גורם להגברה לוגריטמית של כמות קטעי ה-DNA. הקטע המוגבר הינו הקטע התחום בשני הפריימרים שהוספו.

ל-PCR נגזרות רבות. אחת מהן היא שיטת ה- Real-time PCR (תגובת שרשרת של DNA פולימראז בזמן אמת). בשיטה זו קיימים אותם שלושת השלבים של ה-PCR הרגיל, בתוספת חומר המשחרר אות פולרסנטי עם היווצרות מולקולות DNA דו-גדיליות חדשות. כך ניתן לדעת כמה עותקי DNA קיימים בכל מחזור חימום, ולהשליך משם על פעילות הגן המקודד על ידי אותו מקטע DNA. יתרון נוסף לשיטה זו הוא רגישותה. תוצרי PCR רגיל נצבעים בצבע מיוחד (ומסרטן) שנקרא אתידיום ברומיד, ומופרדים על ג'ל אגארוז על ידי אלקטרופורזה (ראו ערך) דבר המאפשר הערכה איכותית (לא כמותית) של כמות ה-DNA. במקרה של Real-time PCR , המכשיר מכיל גלאי פלורסנציה מאוד רגיש המסוגל לתת מידע כמותי על כמות ה-DNA. החסרון היחיד של Realtime PCR הוא מחירו היקר (גם החומרים וגם המכשיר).

 

מאת: ארז גרטי
המחלקה לכימיה ביולוגית
מכון ויצמן למדע

הערה לגולשים
אם אתם חושבים שההסברים אינם ברורים מספיק או אם יש לכם שאלות הקשורות לנושא, אתם מוזמנים לכתוב על כך בפורום. אנו נתייחס להערותיכם. הצעות לשיפור וביקורת בונה תמיד מתקבלות בברכה.

5 תגובות

  • פז

    שאלות

    האם יתרון זה דבר טוב או רע? האם חסרון זה טוב או רע? מה ההבדל בין יתרון להחסרון

  • ענת

    שאלות

    אשמח אם תוכל לפרט מעט יותר על המשפט: "כך ניתן לדעת כמה עותקי DNA קיימים בכל מחזור חימום, ולהשליך משם על פעילות הגן המקודד על ידי אותו מקטע DNA " . מה ניתן ללמוד על פעילות הגן על בסיס מס' עותקי הדנ"א בכל מחזור?
    שנית, על פי הבנתי החומר הפלורסנטי קשור לפריימר וברגע הארכת הפריימרים הוא משתחרר ו"מודיע" על כך.. האם הבנתי נכון?
    תודה על תשובתך.

  • מומחה מצוות מכון דוידסוןארז גרטי

    תשובות

    שלום ענת
    בrealtime בניגוד לPCR רגיל אפשר להעריך כמה עותקים יש בדוגמא אחת ביחס לדוגמא אחרת. כמות העותקים של mRNA נגזרת, בין היתר, מחוזק הפרומוטר, על כן שיטה זו משמשת, בין היתר, לקביעת חוזק פרומוטר.

    2.ישנן שתי דרכים נפוצות, האחת היא להשתמש בחומר פלורסנטי הנספח לDNA דו גדילי, והשניה, כפי שמצויין בסרטון, באמצעות פריימר פלורסנטי, כאשר החומר המדווח משתחרר בזמן התארכות הDNA.
    מקווה שעזרתי
    ארז

  • נדב.

    real time PCR

    מה היתרון של real time PCR על פני PCR אם בכל מקרה אפשר לחשב מתמטית את כמות הגדילים הנוצרת בכל שלב?

  • עידו קמינסקי

    תשובה

    שלום נדב
    ההבדל המהותי בין PCR ל-Realtime PCR הוא הכמותיות. התהליך בשניהם הוא אותו התהליך בדיוק: חימום בשלוש טמפרטורות שונות היוצר הגברה מעריכית של מקטע DNA. על מנת להעריך א כמות ה-DNA ההתחלתית של מקטע מסויים, יש למדוד את כמות ה-DNA שהוגבר בשלב במעריכי (לוגריטמי), כלומר לפני שמאגר הנוקלאוטידים והפריימרים התדלדל, שריכוז האנזים כבר לא הספיק להגביר את כל המקטעים בבת אחת או שיעילות האנזים ירדה. ב-PCR אנחנו מקבלים תוצר סופי בשלב ברוויה, כאשר אין לנו שום יכולת לדעת מתי ההגברה הפסיקה להית מעריכית ולכן גם לא ניתן אפילו להעריך מכמה DNA התחלנו. אני יכול אף להעיד על כך מנסיוני האישי במעבדה ששתי דוגמאות עם ריכוזי DNA שונים נותנים את אותה הכמות של תוצר ב-PCR.

    Realtime PCR מודד את כמות הDNA במהלך התגובה, ומאפשר לזהות את השלב המעריכי ומתי הוא נגמר, ועל כן מתאים יותר להערכה כמותית של ריכוז מקטע ה-DNA אותו אנו רוצים להגביר.

    מקווה שעזרתי

    ארז