השאלה המלאה: מה העיקרון של שימוש בצבענים בהסתכלות על תאים? דוגמאות לצבעני תאים, ומה צובע כל חומר ?
מחמוד שלום,
תודה על שאלתך.
צביעת תאים(Cellular Staining) היא טכניקה שמקלה ומשפרת את הצפייה בדגימות ביולוגיות תחת מיקרוסקופ אור. פעולתה העיקרית היא שיפור ניגודיות הצבעים (ColorContrast: ההבדל בתאורה ובצבע בין עצמים בתמונה, שמאפשר לעצמים להיראות נפרדים יותר).
דוגמה לשיפור הניגודיות בתמונה | התמונה לקוחה מוויקיפדיה; נוצרה בידי Toniht
הצביעה נעשית באמצעות קשירה או תגובה כימית בין מולקולת הצבען (חומר הצביעה) שבו נעשה שימוש לבין המולקולה הספציפית לו. השימוש בשיטה נפוץ בעיקר במיקרוסקופ אור, אך לעתים נעזרים בה גם במיקרוסקופ אלקטרונים. היא נמצאת בשימוש במדעי הביולוגיה, הביוכימיה וברפואה, ובפרט בתחומי ההיסטוכימיה )צפייה ברקמה) והציטולוגיה (צפייה בתאים בודדים).
בעזרת צבענים אפשר להפיק מידע רב יותר מתמונת מיקרוסקופ אור, ולכן מאפשרים להגדיר סוגי רקמות שונות ולהבחין ביניהן, כמו גם בין אוכלוסיות שונות ובין אברונים שונים בתוך התא.
דגימה אחרי צביעה, מוכנה לצפייה במיקרוסקופ אור | התמונה לקוחה מוויקיפדיה; נוצרה בידיEvery1blowz
איך מכינים דוגמה צבועה לצפייה במיקרוסקופ ?
הכנת הדגימה דורשת כמה שלבים, שלא כולם הכרחיים תמיד:
1. החדרה: תהליך שבו ממיסים את ממברנת התא כדי לאפשר למולקולות צבע גדולות לחדור לתוך התא.
2. קיבוע: תהליך שמשמר את התא או הרקמה כדי שלא ישתנו בעקבות תהליך ההכנה של הדגימה. הקיבוע מתבצע על ידי הוספה של חומר כימי שיוצר קשרים כימיים עם החלבונים ומגדיל את הקשיחות שלהם.
3. הרכבה: השלב שבו מניחים את הדגימה על גבי זכוכית מיקרוסקופ לצורך צפייה. במקרה של תאים, הדגימה גדלה על הזכוכית או מועברת אליה בטכניקה סטרילית. חתכים של רקמה מועברים לזכוכית לצורך צפייה תחת המיקרוסקופ.
4. צביעה: השמה של הצבען על הדגימה (תאים, רקמות, אברונים). בתהליך הצביעה מכניסים את הדוגמה לתמיסת הצבע ולאחר מכן שוטפים אותה.
דוגמאות לצבענים ביולוגיים
המטוקסילין (Haematoxylin): חומר שצובע את גרעין התא בכחול-סגול או בחום. כמות הצבע הכחול עשויה להעיד על תהליך ממאיר (סרטן).
אאוזין (Eosin): צבע ניגוד להמטוקסילין. באמצעותו צובעים באדום-ורוד את ממברנת תא ואת נוזל החוץ (ציטופלזמה) והמיטוכונדריה (אברון בתא).
יוד (Iodine): נמצא בשימוש כאינדיקטור (מראֵה) להימצאות של עמילן. בנוכחות יוד, עמילן ישנה את צבעו לכחול כהה.
קומאסי כחול (Coomassie Blue): צבען כחול שנקשר לחלבונים. נמצא בשימוש נרחב לצורך הפרדת חלבונים על ידי אלקטרופורוזה בג'ל.
ג'ל אלקטרופורזה על ג'ל של דוגמאות חלבונים אחרי צביעה בעזרת קומאסי כחול | התמונה לקוחה מוויקיפדיה; נוצרה בידי Itayba
די אמידינו פניל אינדול (DAPI): צבען פלורוסנטי שנקשר לגרעין התא ומושפע מאור על-סגול. צבע כחול נפלט ממנו בעת הקשירה לדנ"א שבגרעין התא. אפשר להשתמש בצבען הזה גם בתאים חיים.
שיטות צביעה עיקריות
צביעת גראם: שיטה להפרדה של חיידקים לשתי קבוצות עיקריות: גראם חיובית וגראם שלילית. השיטה מבדילה בין החיידקים לפי התכונות הכימיות והפיסיקליות של דפנות התא. חיידקים גראם חיובים ייצבעו בכחול-סגול וחיידקים גראם שליליים יצבעו באדום-ורוד. השיטה קרויה על שם מי שפיתח אותה: הנס כריסטיאן גראם (1938-1853).
דוגמה לחיידקי גראם שלילי (בוורוד) מסוג Baculli וחיידקי גראם חיובי (בסגול) מסוג Cocci בהגדלה פי 1,000 | התמונה לקוחה מוויקיפדיה; נוצרה בידי Ytambe
צביעת המטוקסילין-אאוזין: השיטה מבוססת על שימוש בהמטוקסילין ובאאוזין כצבע ניגוד. הצביעה מבוססת על שוני בחומציות ובבסיסיותשל רכיבי הרקמה השונים. החומציים שבהם (שנקראים בזופיליים – אוהבי בסיס) ייצבעו בכחול (למשל גרעיני התאים, שמכילים את הדנ"א המורכב מחומצות גרעין) והבסיסיים (אאוזינופילים – אוהבי אאוזין או אצידופיליים – אוהבי חומצה) ייצבעו בוורוד (לדוגמה חומרי הציטופלזמה, המיטוכונדריה, סיבי הקולגן וסיבי השריר).
צביעה של רקמת ריאה בהמטוקסילין-אאוזין בהגדלה פי 10 | התמונה לקוחה מוויקיפדיה; נוצרה בידי Kilbad
צביעת Periodic Acid-Schiff (PAS): שיטה שצובעת באדוםבעיקר סוכרים, ולכן יעילה בצביעתהממברנה המכילה גליקופרוטאינים ופרוטאוגליקנים.נמצאתבשימוש בזיהוי מחלות הקשורות באגירת גליקוגן.
צביעה של רקמת כבד בשיטת PAS, שמראה פטריית היסטופלסמה | התמונה לקוחה מוויקיפדיה; נוצרה בידי Nephron
צביעת Masson: שיטה שמשתמשת בשלושה צבענים ומתאימה מאוד להפרדה של תאים מהרקמה המחברת. מדגישה קולגן בגווני ירוק, קרטין באדום, וציטופלסמה בוורוד.שימושית במיוחד לאבחנת פיברוזיס (סוג של בעיה ריאתית).
צביעה ויטאלית: שיטת צביעה לתאים חיים, שנעשית על ידי הזרקת חומר ליצור החי. משתמשים בה כדי להעריך את החיוניות (Viability) של תא או של רקמה. דוגמאות לצבענים ויטאליים: אאוזין, פרופידיום יודיד, טריפאן כחול, אריטרוזין.
צביעות אימונוהיסטוכימיות: צביעות המבוססות על נוגדנים, שמאפשרות לאבחן נוכחות של חלבון (אנטיגן) ספציפי ברקמה. איתור החלבון נעשה על ידי קישור של נוגדנים ספציפיים, והצפייה בו במיקרוסקופ אור מתאפשרת בזכות אנזימים שמחוללים תגובת צבע. השיטה משמשת כאמצעי לאבחון גידולים סרטניים וגם כשיטת מחקר המאפשרת איתור חלבונים שונים ברקמות ובחינת השפעתם על התפתחות מחלות, למשל לצורך חיפוש אחרי חלבון מסוים כדי לאפשר את השימוש בתרופה הביולוגית הרצפטין לטיפול בסרטן השד.
בתרשים הבא אפשר לראות דוגמה לצביעה אימונוהיסטוכימית המכילה מספר רב של אנטיגנים. התא נחשף לנוגדן (באדום) המצומד כימית לאנזים (כחול) ונקשר לאנטיגן ספציפי (ריבוע סגול). האנזים נקשר למולקולת המצע (סובסטראט) ומשנה את צבעו (כוכב חום).
צביעה אימונוהיסטוכימית של תא בעזרת נוגדן | התרשים לקוח מוויקיפדיה;נוצר בידיItayba
צביעה במיקרוסקופ אלקטרונים
צבענים לשיפור הניגודיות בתמונה נמצאים בשימוש גם במיקרוסקופ אלקטרונים חודר. במקרה זה הצבענים מבוססים על מתכות כבדות בעלי צפיפות אלקטרונים גבוהה. דוגמאות לצבענים של דוגמאות ביולוגיות במיקרוסקופי אלקטרונים: חומצה טונגסטו-פוספורית, אוסמיום טטרוקסיד, רוטניום או טטרוקסיד.
בומרנג – בחזרה אליך
מתילן כחול משמש לצביעת בקטריות בכחול, אך יש לו שימושים רבים אחרים. האם תוכל לנחש למה משתמשים בו באקווריום ביתי? לשם האתגר אתה מוזמן להסביר גם איך הוא משמש כאינדיקטור להימצאות חיידקים בחלב.
עופר רוטלוי
מכון דוידסון לחינוך מדעי
מכון ויצמן למדע
הערה לגולשים
אם אתם חושבים שההסברים אינם ברורים מספיק או אם יש לכם שאלות הקשורות לנושא, אתם מוזמנים לכתוב על כך בפורום ואנו נתייחס להערותיכם. הצעות לשיפור וביקורת בונה יתקבלו תמיד בברכה.
